Jaren zijn verstreken sinds de vorige film. Andy is inmiddels 17 jaar en zal spoedig naar de universiteit gaan. Zijn vroegere speelgoedvriendjes, waaronder Woody en Buzz Lightyear, maken zich zorgen over wat er met hen zal gebeuren, daar al veel van Andy’s stukken speelgoed verkocht zijn op de rommelmarkt.

Aanvankelijk wil Andy zijn speelgoed opruimen op zolder, maar door een vergissing belanden ze in een vuilniszak op straat. Denkend dat Andy hen bewust heeft weggegooid, besluiten de poppen om zich te verstoppen in een doos met spullen bestemd voor een kinderdagverblijf. In het kinderdagverblijf worden Andy’s poppen met open armen onthaald door het reeds aanwezige speelgoed, maar Woody is er niet gerust op.

Woody vertrekt uiteindelijk om eigenhandig Andy te gaan zoeken. Hij komt echter niet ver daar hij wordt gevonden door een meisje genaamd Bonnie, dat hem mee naar huis neemt. Bij haar thuis maakt Woody kennis met haar speelgoed; Chuckles de Clown, Mr. Pricklepants, Trixie, Buttercup, Dolly, en Totoro. Chuckles blijkt zelf ook in het kinderdagverblijf te hebben gezeten en bevestigt Woody’s vermoeden dat er iets niet in de haak is daar. Chuckles en Lotso, een speelgoedbeer die nog in het kinderdagverblijf is, waren ooit eigendom van een meisje genaamd Daisy. Toen de twee echter in het kinderdagverblijf terecht kwamen omdat Daisy schijnbaar nieuw speelgoed had gekregen, knapte er iets bij Lotso. Hij en zijn helper, Big Baby, hebben het verblijf tot een gevangenis gemaakt voor al het speelgoed dat er terecht komt.

Woody maakt plannen om zijn vrienden uit het kinderdagverblijf te redden. Ondertussen laat Lotso Buzz Lightyear resetten daar hij bang is dat Buzz zijn plan zal ontdekken. Hierdoor verandert Buzz weer in de aan waanideeën lijdende pop die hij in de eerste film was. Lotso doet zich voor als Buzz’ commandant, en beveelt hem de andere poppen in het gareel te houden. Een poging van de poppen om Buzz weer normaal te maken resulteert enkel in dat hij gereset wordt naar een Spaanstalige versie van zichzelf.

Woody arriveert weer in het kinderdagverblijf en maakt met de anderen plannen om te ontsnappen. Ook overtuigt hij de helpers van Lotso dat hij hen allemaal voor zijn karretje spant. Lotso wordt kwaad en er breekt een gevecht uit waarbij alle poppen uiteindelijk in een vuilniswagen terecht komen. Buzz wordt getroffen door een weggegooide tv en springt hierdoor terug naar zijn normale programmering. Lotso wordt verslagen en de poppen kunnen ontsnappen voor ze in de verbrandingsoven van de vuilnisbelt belanden.

De poppen keren terug naar Andy’s huis. Woody wil echter niet dat ze allemaal op zolder worden weggestopt, dus spoort hij de anderen aan om in een doos te kruipen en deze te adresseren aan Bonnie. Andy vindt de doos, en komt zelf ook tot de conclusie dat zijn speelgoed aan Bonnie geven wellicht beter is.